Prueba de PCR

Maximilian Reindl estudió química y bioquímica en la LMU de Múnich y ha sido miembro del equipo editorial de desde diciembre de 2020. Él se familiarizará con los temas médicos, científicos y de políticas de salud para que sean comprensibles y comprensibles.

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Las pruebas de PCR se han convertido en una parte indispensable de la medicina moderna y el diagnóstico molecular. Debido a que son tan precisos, se consideran el "estándar de oro". Se pueden utilizar en una amplia gama de aplicaciones, desde la detección de patógenos hasta la detección de enfermedades hereditarias, es decir, donde sea necesario para detectar de forma fiable incluso los rastros más pequeños de material hereditario. Descubra aquí por qué la prueba de PCR es tan precisa, dónde se utiliza y cómo funciona en detalle.

¿Qué es una prueba de PCR?

Una prueba de PCR es un método de laboratorio de biología molecular y medicina. La prueba se utiliza para la detección directa y caracterización de material genético. Los expertos consideran que el método de PCR es fácil de realizar, de aplicación universal y robusto.

En el laboratorio, una prueba de PCR consta de dos pasos. En un primer paso, el material genético existente se reproduce con la ayuda de la reacción en cadena de la polimerasa, o PCR para abreviar. De esta manera, se pueden examinar los rastros más pequeños de ADN. Esta es también la razón por la que las pruebas de PCR son tan sensibles.

En un segundo paso, el material genético se separa, “clasifica” y así se caracteriza según sus propiedades. Entonces se determina la estructura fina del ADN.

Hay muchos usos posibles: los médicos usan una prueba de PCR para examinar, por ejemplo, frotis para coronavirus, donaciones de sangre para el VIH o detectar a los recién nacidos en busca de posibles enfermedades hereditarias. Las infecciones bacterianas, por ejemplo con el patógeno de la tuberculosis, o las infecciones parasitarias (malaria) también se pueden aclarar con la PCR.

También ayudan en la medicina forense a condenar a los delincuentes en función de su huella genética o se utilizan como pruebas de paternidad.

Todas estas aplicaciones se resumen bajo el término diagnóstico molecular. Por lo tanto, la PCR encuentra una aplicación práctica en la investigación, el diagnóstico y la medicina forense mucho más allá de la detección del patógeno Sars-CoV-2.

Prueba de PCR (Corona) versus prueba de PCR rápida

Por lo general, la evaluación de una prueba de PCR se realiza en un laboratorio especializado. Esto significa que el material de muestra se envía y se examina allí. El resultado generalmente se recibe unos días después.

Varias empresas emergentes (GNA Biosolutions, Spindiag) presentaron recientemente nuevos tipos de dispositivos de prueba móviles. Para ello también recibieron aprobaciones especiales del Instituto Federal de Medicamentos y Productos Sanitarios (BfArM). Con la ayuda de estos dispositivos móviles de prueba de PCR, una prueba de PCR también sería posible sin un laboratorio especializado.

Este enfoque tiene un gran potencial, ya que un resultado de prueba confiable podría estar disponible en unas pocas horas directamente en el lugar donde se tomó la muestra (centro de prueba).

Aún no se puede evaluar en qué medida prevalecerán en la práctica tales sistemas de prueba de PCR rápida. Tampoco se sabe todavía con qué rapidez se suministrarán estos dispositivos a los centros de pruebas en todos los ámbitos.

Por tanto, en un futuro previsible se seguirán realizando pruebas de PCR "periódicas" de laboratorio, lo que provoca un cierto retraso entre la toma de muestras y el resultado de la prueba.

¿Qué tan confiable es una prueba de PCR?

La PCR es un método de detección probado en la medicina y el diagnóstico molecular. Se considera el llamado patrón oro con una tasa de error muy baja. Las pruebas se caracterizan particularmente por una sensibilidad y especificidad muy altas.

Sensibilidad significa la confiabilidad con la que una prueba encuentra el material genético que se va a detectar.

Especificidad significa la certeza con la que la prueba determina que el material genético en cuestión no está presente en la muestra.

¿Cuándo funcionan las pruebas de PCR en caso de infección por Sars CoV-2?

Como regla general, la prueba de PCR detecta una infección por corona dos o tres días antes y hasta 20 días después de la aparición de los síntomas. Incluso con personas infectadas que permanecen completamente libres de síntomas, la prueba funciona en una ventana de tiempo crítica en la que pueden infectar a otras personas.

En casos individuales, la prueba de esto es posible incluso 60 días después de que aparezcan los síntomas de la enfermedad.

El primer día después de una infección por corona, una prueba de PCR también puede ser negativa, aunque haya una infección. En tal caso, no había suficientes virus en la garganta en el momento de la prueba de frotis. Sin embargo, si existe una sospecha razonable de infección, los médicos suelen realizar otra prueba de PCR en los días siguientes.

posibles fuentes de error

La tasa de error en el proceso de copia de ADN es insignificante en la práctica. Aunque las ADN polimerasas nunca funcionan correctamente, difícilmente desempeñan un papel en el proceso de la prueba de PCR.

En la práctica, las posibles fuentes de error se encuentran en el proceso de muestreo: por lo tanto, es importante que personal médico capacitado realice los frotis. Las muestras de saliva y gárgaras posiblemente podrían reducir la precisión, ya que aquí se producen efectos de dilución.

¿Cómo funciona una prueba de PCR?

Una prueba de PCR la realiza, por ejemplo, el médico de familia o en centros de pruebas especiales. Primero, los médicos o profesionales de la salud capacitados toman una muestra. Por lo general, se toma un hisopo de las vías respiratorias superiores para la prueba. Esto generalmente toma la forma de un frotis de la boca o la nariz y la garganta.

También es posible hacer gárgaras con una solución de enjuague. Una muestra de sangre es atípica para la detección de corona, pero está muy extendida, por ejemplo, en la detección de recién nacidos.

Independientemente del tipo de muestra que se tome, el material genético se encuentra en el hisopo de algodón, en la solución de enjuague o en una gota de sangre. Este material de muestra se envía a un laboratorio, donde se aísla y se purifica.

Luego, una prueba de PCR se divide en dos pasos:

  • PCR: en este paso, se multiplica la cantidad de material genético original.
  • Electroforesis: en el segundo paso, los segmentos del genoma se "clasifican" según el tamaño. De esta manera, se puede caracterizar la muestra: se determina la estructura fina del material genético.

Paso 1: PCR - "La reacción en cadena de la polimerasa"

La "PCR" es el primero de dos pasos de trabajo: Aquí se multiplica la cantidad de ADN inicial existente. Porque solo cuando el material genético está disponible en cantidad suficiente se puede examinar. En su mayoría, se trata de ADN humano; las pruebas para el coronavirus son, en consecuencia, ARN del virus.

La abreviatura PCR significa el término inglés "Polymerase Chain Reaction".

¿Qué se necesita para un PCR?

El ADN de partida se encuentra en un recipiente de reacción con sustancias especiales. El material genético existente sirve como plantilla, que se copia en presencia de ciertas enzimas (polimerasa Taq) y ciertos componentes básicos del ADN.

El proceso de copia se lleva a cabo en varias ejecuciones (ciclos) repetitivas.

En concreto, se combinan las siguientes sustancias:

  • ADN inicial: material de muestra a replicar.
  • Componentes básicos del ADN: estas son las nucleobases adenina, timina, citosina y guanina.
  • ADN polimerasa: Enzima que une los componentes básicos del ADN para formar una cadena bien definida de ADN. La hebra recién obtenida es una imagen reflejada (complementaria) del material de partida original.
  • Solución tampón: la reacción en cadena de la polimerasa tiene lugar en una solución tampón fisiológica. Esto asegura condiciones similares a las que se encuentran en las células humanas. Esta solución mantiene estable el pH y también contiene iones de magnesio. Estas condiciones controladas son necesarias para asegurar la funcionalidad de la ADN polimerasa.
  • Cebadores: constan de 16 a 24 pares de bases y sirven como posición de inicio y señal de inicio. Los cebadores muestran la ADN polimerasa en qué punto (del ADN inicial) comienza el proceso de copia.

¿Cómo se realiza una prueba de PCR?

Dado que todas las sustancias necesarias para una PCR se encuentran ahora en el recipiente de reacción, puede comenzar el proceso de copia real del material genético. Esto solo se inicia, controla y detiene nuevamente por la temperatura.

En consecuencia, el recipiente de reacción se calienta o enfría de manera selectiva a diferentes temperaturas. Esto se hace con un dispositivo especial: el llamado termociclador. La reacción total tarda entre una y dos horas.

Los pasos individuales de un ciclo de PCR son:

  • Desnaturalización de las cadenas dobles de ADN: la muestra se calienta a unos 90 grados centígrados. Como resultado, la doble hebra de ADN original se rompe en dos hebras simples separadas (complementarias).
  • Fijación de la imprimación: la temperatura se reduce ligeramente por debajo de los 60 grados centígrados. Como resultado, los cebadores (cebadores directos, cebadores inversos) se unen a posiciones definidas en las hebras individuales correspondientes de ADN.
  • Extensión: la temperatura aumenta a algo más de 70 grados centígrados. La ADN polimerasa comienza ahora su trabajo en esta temperatura óptima. Se adhiere a las posiciones del cebador y extiende la hebra única original de ADN paso a paso hasta que se dispone de una copia exacta (complementaria) (síntesis de ADN).

Después de un ciclo completo, la temperatura vuelve a aumentar a unos 90 grados Celsius; el ciclo comienza de nuevo.

Usando el método de PCR, las secuencias de ADN se pueden replicar hasta alrededor de tres pares de kilobase (kbp). Esto corresponde a alrededor de 3.000 bloques de construcción de ADN básicos vinculados para formar una "cadena". A modo de comparación: el genoma humano almacena los planos y la información para el funcionamiento de la célula en alrededor de tres mil millones de pares de bases; el genoma del coronavirus, por otro lado, consta de 30.000 pares de bases. Una prueba de PCR solo se puede utilizar para reproducir y examinar secciones cortas del ADN total.

Los cebadores son cruciales

La elección de los cebadores es fundamental para el proceso de PCR. En el diagnóstico de Sars-CoV-2, por ejemplo, se utilizan varios cebadores (PCR multiplex).

Las pruebas Corona PCR buscan tres genes de virus diferentes: la especificidad general aumenta a casi el 99,99%. Esto significa que con esta alta tasa de aciertos, solo hay una prueba de falso positivo por cada 10,000 exámenes (si la muestra se toma correctamente).

¿Cuánto material genético copiado hay ahora?

Supongamos que después del primer ciclo hay dos cadenas dobles de ADN idénticas.

Después de cada ciclo, la cantidad de material genético (copiado) se duplica. Entonces, la cantidad de ADN crece exponencialmente.

En otras palabras: después del segundo ciclo hay cuatro hebras dobles idénticas - después del tercer ciclo ocho hebras dobles - después del cuarto ciclo 16 hebras dobles y después del quinto ciclo ya 32 hebras dobles.

Los profesionales médicos suelen repetir este proceso entre veinte y treinta veces.

Hablando metafóricamente, esto significa: incluso si al principio solo se encontrara una única doble hebra de ADN en la muestra, después de veinte ciclos ya habrá un millón de copias idénticas en el recipiente de reacción.

¿Qué significa el valor Ct?

El número de ciclos de PCR completados se da en forma del denominado valor Ct. "Ct" se deriva del término inglés "umbral de ciclo". Este valor Ct permite hacer declaraciones sobre la cantidad de material genético que se busca.

Con un valor Ct bajo de 20, hay mucho material genético inicial. Sin embargo, si el valor de Ct es alto, alrededor de 30 ciclos, hay, en consecuencia, poco ADN. Por lo tanto, el ciclo de PCR debe ejecutarse con más frecuencia.

Paso 2: Electroforesis "Clasificación por tamaño"

Finalmente, si hay suficiente material genético “enriquecido”, se puede realizar lo que se conoce como electroforesis. Los científicos utilizan una determinada propiedad del ADN: su carga eléctrica.

Los bloques de construcción de ADN individuales están unidos entre sí a través de una columna vertebral de azúcar-fosfato cargada (negativamente). Cuanto más larga es una determinada secuencia de ADN, mayor es su carga eléctrica.

Si el material genético se coloca en un medio portador específico (agarosa) y se aplica un voltaje eléctrico, los segmentos de ADN comienzan a moverse debido a su carga. Dado que un tramo más largo de ADN viaja más rápido que un fragmento más corto, se separan según el tamaño.

De esta forma, se puede examinar y caracterizar el material genético. En la práctica, una muestra desconocida con una referencia conocida generalmente se aplica a una "línea de partida" y se compara entre sí después de un cierto período de tiempo.

Si la "velocidad de migración" es la misma para ambas secuencias, esto significa: Es muy probable que la detección sea positiva: el gen que está buscando está contenido en la muestra.

Caso especial de coronavirus: preparación de muestras y RT-PCR

La detección de patógenos para el coronavirus es un caso especial, el Sars-CoV-2 es uno de los denominados virus de ARN. Esto significa que el genoma de Sars-CoV-2 está en forma de ARN (ácido ribonucleico).

El ARN se diferencia del ADN solo en algunos aspectos. Entre otras cosas, está disponible como una sola hebra y se basa en el azúcar ribosa en lugar de desoxirribosa de 2 ". La nucleobase timina también ha sido reemplazada por uracilo como cuarta base.

Este ARN viral debe "transcribirse" en ADN antes de una prueba de PCR regular. Este proceso se denomina transcripción inversa (RT), de ahí el término RT-PCR. En el transcurso de este proceso, se obtiene una sola hebra de ADNc ("ADN complementario"). En un paso adicional, la única hebra de ADNc se complementa con una segunda hebra de ADN invertida en espejo.

Al final de la preparación de la muestra, hay una doble hebra de ADN que corresponde al modelo original del ARN del virus: ahora solo esta doble hebra se puede utilizar como plantilla en una prueba de PCR.

¿Cuánto tiempo se tarda en obtener el resultado?

Después de enviar la muestra al laboratorio, generalmente recibirá un resultado después de uno o dos días hábiles.En los centros de pruebas, que a menudo examinan las muestras en el lugar, esto solo puede llevar unas pocas horas. El período de tiempo depende en gran medida del centro de pruebas respectivo y su logística.

A pesar de los complejos procesos de trabajo, los laboratorios modernos pueden realizar pruebas de PCR con alto rendimiento. Los dispositivos automatizados especiales ayudan con la implementación.

La prueba de PCR todavía se considera un método de detección comparativamente "lento" pero aún más confiable.

¿Qué pasa si el resultado es positivo?

Si la muestra se toma correctamente, una prueba de PCR positiva significa que es muy probable que la persona examinada esté infectada con Sars-CoV-2.

Si se ha confirmado que está infectado con el coronavirus con la ayuda de una prueba de PCR, el departamento de salud recibirá un mensaje del laboratorio respectivo sobre el resultado positivo de la prueba. En tal caso, el departamento de salud ordenará el aislamiento o la cuarentena.

¿Soy contagioso automáticamente si obtengo una prueba de PCR positiva?

La mayor parte del tiempo sí. Pero no siempre. El resultado de una prueba de PCR siempre debe interpretarse en contexto. Una prueba positiva significa principalmente que tiene material viral en su interior.

Si recientemente ha sufrido de Covid 19 (unos días), una prueba de PCR aún podría ser positiva, aunque ya esté sano nuevamente. Este es un caso especial y la desventaja de una prueba altamente sensible, ya que también puede detectar fragmentos de un virus que no se puede reproducir.

A veces es útil una prueba de anticuerpos complementaria

En tales casos, una prueba de anticuerpos proporciona certeza que asegura la validez de la prueba de PCR. Es mejor hablar de esto con su médico. Pueden ayudarlo a interpretar correctamente el resultado de una prueba de PCR.

Qué hacer si el resultado es negativo

Un resultado negativo de la prueba de PCR significa con una alta probabilidad de que no contrajo Covid-19 cuando se tomó la muestra y, por lo tanto, actualmente no es contagioso. Sin embargo, es posible que se encuentre en las primeras etapas de la infección.

Por lo general, las infecciones por corona solo se pueden detectar a partir del segundo o tercer día después de la infección. Entonces el resultado no es un boleto gratis. Por lo tanto, debe continuar respetando las reglas de distancia e higiene y continuar usando una máscara FFP2, para usted y para la protección de los demás.

Prueba de PCR en niños

Una prueba de PCR pediátrica no es diferente de una prueba de PCR para adultos. Tanto el muestreo como la interpretación de los resultados se aplican tanto a niños como a adultos.

¿Cuáles son los riesgos de una prueba de PCR?

Una prueba de PCR no presenta riesgos físicos. Algunas personas solo perciben como molesto o desagradable el muestreo por hisopado nasofaríngeo.

¿Cuánto cuesta una prueba de PCR?

Todos los costos incurridos por una prueba de PCR estarán cubiertos si sus médicos tratantes o el departamento de salud aprueban dicha prueba. Por lo general, se considera el reembolso de los costos si ya tiene síntomas propios o si ha tenido contacto directo con personas infectadas.

Incluso en el caso de una prueba rápida o autoprueba positiva, tiene derecho a una prueba de PCR gratuita.

Tenga en cuenta: si se ha realizado la prueba en casa y ha obtenido un resultado positivo, debe programar una cita con su médico de cabecera inmediatamente por teléfono. Su médico tratante discutirá con usted el procedimiento adicional por teléfono.

Alternativamente, es mejor llamar al 116 117 para registrarse para una prueba de PCR. Hasta la prueba de confirmación, lo ideal es que se quede en casa para protegerse y proteger a los demás.

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